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对一氧化碳中毒迟发脑病相关因素的研究
首都医科大学附属北京红十字朝阳医院*高压氧科 葛 环 武连华 高春锦 庞宝森
山东莱州市人民医院**高压氧科 姜秀芹
摘要 目的：观察大鼠一氧化碳中毒（COP）后脑组织一氧化氮合酶（NOS）、外周血内皮细胞计数、血小板体积变化、血小板CD16表达、多形核白细胞粘附分子（CD11b／CD18）。表达、海马神经细胞凋亡细胞百分比及线粒体膜电位的改变。方法：Wistar大鼠共48只随机分成正常对照组及一氧化碳中毒不同时期共5组（CO）各8只、制作COP动物模型。用流式细胞仪测定大鼠脑组织一氧化氮合酶（NOS）、外周血内皮细胞计数、血小板体积变化、血小板CD16表达、多形核白细胞粘附分子（CD11b／CD18）表达的动态变化，海马神经细胞调亡细胞百分比及线粒体膜电位的改变。用分光光度法测定血浆组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和抑制剂（PAI）。结果：COP后NOS活性降低，血小板活性增高，纤溶系统变化不明显，细胞粘附分子表达增加，线粒体膜电位降低，凋亡细胞数增加。结论：COP后血小板活性增高细胞粘附分子表达增加，导致脑微小动脉血栓形成并引起白细胞浸润造成组织损伤，是COP迟发脑病的重要发病因素之一。
关键词：一氧化碳中毒迟发脑病
细胞粘附分子 血小板活性 线粒体膜电位 细胞凋亡
本研究动态观察COP后NOS，血小板活化状态细胞粘附分子表达、线粒体膜电位及细胞凋亡等动态变化，探讨COP迟发脑病的发病机理。
材料与方法
1．实验动物及分组
健康成年Wistar大鼠48只，雌雄不拘，体重200~250g，动物被随机分成6组。正常对照组8只，COP（CO）组各8只（COP后立即、第5天、第10天、第15天、第20天）。
动物模型制作：向直径47.2cm，高56cm密闭染毒罐中注入99.8％CO气体265ml。分组将大鼠放人染毒罐中，静式吸入含CO的空气60min，期间用CO检测仪测定罐内CO浓度3次，其浓度均为2950ppm。染毒开始，动物表现活跃，5~6min后开始躁动，8min时四胜瘫软无力，呼吸急促60~80次／min。15min后大部分大鼠昏迷，（80％）。60min后出罐，出罐后30min大鼠陆续苏醒，初期精神萎靡，1h后在外观上与对照组无明显差别。
标本采集：乙醚麻醉大鼠，迅速从心脏抽血3ml，其中2ml离心，2000r／min、15min，取血浆用酶免检测；另1ml用流式细胞仪检测，方法按说明书进行。切开颅骨，取左右海马组织各50mg：取左右两侧大脑皮质各50mg左右。
2．主要仪器设备
美国BD公司FACSalibur流式细胞仪。
美国伯乐550型酶标仪。
3．检测项目
（1）大鼠大脑皮质海马神经细胞NOS测定：脑组织常规切成4微米厚切片，采用SP法行免疫组织化学染色，DAB显色。染色前用微波行抗原修复。切片用高清晰图象分析系统进行分析，每张切片随机分析10个高倍视野大脑皮质区，每个高倍视野分析10个细胞，计算该100个细胞的平均辉度，再用背景的辉度除以该100个细胞的平均辉度，所得值表示该例脑皮质神经细胞NOS的相对表达量。
（2）外周血血小板CD16测定：常规办法制备标本，上机检测前用BD公司标准Beads校准流式细胞仪，使CV值小于2％，用实验管的平均荧光强度与对照管的平均荧光强度的比值表示CD61的相对表达量。
（3）外周血循环内皮细胞测定：用CD31与CD45双标记外周血，对外周血有核细胞设门，每例收集5万个有核细胞；统计有核细胞中CD45阴性，CD31强阳性的细胞数，即内皮细胞数。
（4）外周血血小板相对体积测定：方法同（2）。用FSC的平均值表示血小板的平均大小。
（5）tPA及PAI测定：采用美国伯乐550型酶标仪，用酶联免疫法测定。其试剂盒购于福建太阳生物技术研究所，实验技术操作按说明书进行。
（6）外周血多形核白细胞粘附分子（CD11b／CD18）测定；用实验管中性粒细胞的平均荧光强度与对照管中性粒细胞的平均荧光强度的比值表示（CD11b／CD18）的相对表达量。
（7）大鼠海马神经细胞线粒体膜电位测定：取海马组织，制备成单个细胞悬液，调节细胞浓度为106／ml，加入Radmine123储备液使之终浓度为10μm。在37℃避光孵育60min，PBS洗2次，上机检测。用荧光指数表示线粒体膜电位。
（8）凋亡细胞测定：制备单个细胞悬液，调节细胞浓度为106／ml，用Annexin
V及PI对神经细胞进行双标记，记录Annexin V阳性PI阴性细胞数的百分比，即早期凋亡细胞。
3．统计学处理与对照组两样本比较采用t检验，各组间比较采用方差分析。
结 果
1．大鼠海马神经元NOS的变化（表1） 大鼠海马神经元NOS在CO中毒第1、5、10天较对照组明显降低（P＜0.01），在第15、20天恢复正常。对不同时间组间作F检验，结果所见，P＜0.01。
2．内皮细胞计数的变化（表1）
大鼠外周血在COP第1、5、10、15、20天与对照组相比明显升高（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.05）；F检验，结果所见，P＜0.01。
3．血小板体积的变化（表1）
大鼠外周血血小板相对体积在COP后第1天与对照组相比无显著性差异（＞0.05）。第5、10天，较对照组明显增高（P＜0.01）（P＜0.01），第15、20天与对照相比无显著性差异（＞0.05）。作F检验，结果所见，P＜0.01。
4．外周血血小板CD61表达的变化（表1）
大鼠外周血血小板CD61在COP后第1、5、10天明显高于对照组（P＜0.01）（P＜0.05）（P＜0.05），第15、20天与对照组相比无显著性差异（＞0.05）。作F检验，P＜0.01。
5．血浆tpA的变化（表1） 大鼠血浆tpA在COP后第10天与对照组相比有所下降（P＜0.05），其他组与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。作F检验，结果所见，P＞0.05。
6．血浆PAI的变化（表1） CO、CP及CH三组大鼠外周血浆PAI值在COP后无明显升高或下降（P＞0.05）。对不同时间组间分别作F检验，结果所见，P＞0.05。
7．大鼠外周血多形核白细胞（CD11b／CD18）相对表达量的变化（表1）
COP后第1、5、10、15、20天升高（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.05）；对不同时间组间分别作F检验，P＜0.01。
8．大鼠海马神经细胞线粒体膜电位的变化（表1） 大鼠线粒体膜电位在COP后第1、5、10天降低（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.05），在第15天、20天与对照组相比无显著性差异（＞0.05）。对不同时间组分别作F检验，结果，P＜0.01。
9．大鼠海马神经细胞凋亡的变化（表1） CO组大鼠海马神经细胞凋亡数的百分比在COP后的1、5、10、15、20天均明显高于对照组（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.01）（P＜0.01）。统计学处理，均为（P＜0.01）。对不同时间组间分别作F检验P＜0.01。
表1 一氧化碳中毒时与迟发性脑病相关因素的变化（ ±D）
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对照组
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COP组
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第1天
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第5天
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第10天
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第15天
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第20天
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NOS
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1.958±0.036
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1.608±0.053**
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1.751±0.056**
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1.834±0.104**
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1.901±0.121
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1.917±0.033
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内皮细胞计数
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21.50±9.62
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65.14±11.85**
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69.29±18.22**
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61.33±10.98**
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51.67±19.67**
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36.00±15.46*
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血小板体积
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61.01±6.95
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65.72±19.36
|
89.54±27.30**
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84.43±17.41**
|
66.35±1.37
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62.44±12.17
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血小板CD61
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65.97±13.14
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110.33±7.94**
|
83.04±6.02*
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84.39±4.95*
|
81.72±9.92
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78.20±10.25
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tPA测定
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0.59±0.14
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0.61±0.13
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0.72±0.10
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0.55±0.07
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0.60±0.20
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0.79±0.06
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PAI测定
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0.85±0.07
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0.64±0.05
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0.84±0.07
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0.76±0.10
|
0.74±0.09
|
0.79±0.06
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CD11b／CD18
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433.20±57.49
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700.00±67.99**
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674.40±39.71**
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633.85±52.13**
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597.18±53.51**
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453.00±25.74*
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线粒体体膜电位
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203.10±18.00
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112.17±28.72**
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132.12±26.46**
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150.87±24.35**
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167.62±20.46
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195.25±20.40
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神经细胞凋亡
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0.063±0.099
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1.750±0.502**
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1.766±0.385**
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1.211±10.378**
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0.950±0.365**
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0.531±0.266**
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注：与对照组相比 * P＜0.05 ** P＜0.01
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