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高压氧对急性一氧化碳中毒细胞粘附分子
及血小板活性影响的实验研究
首都医科大学附属北京红十字朝阳医院*高压氧科 李 茁
摘要 本课题目的为观察动物急件一氧化碳中毒后粘附分子表达及血小板活性的动态变化以及高压氧治疗对其影响。将实验动物Wistar大鼠共128只随机分成正常对照组、一氧化碳中毒组（CO）、一氧化碳中毒+高气压组（CP）、一氧化碳中毒+高压氧组（CH）。用流式细胞仪测定一氧化碳中毒后1、5、10、15、20d大鼠外周血内皮细胞计数、血小板体积变化。血小板CD61表达、多形核白细胞粘附分子（CD11b／CD18）表达的动态变化。统计学处理采用t检验、方差分析，并进行上述各项指标间的相关分析。实验结果表明，一氧化碳中毒后，大鼠外周血血小板活性增强，血浆循环内皮细胞增多，外周血多形核白细胞粘附分子CD11b／CD18表达增加。高压氧组较一氧化碳中毒组血小板活性、血管内皮细胞损伤及细胞粘附分子表达较快恢复正常。提示一氧化碳中毒后内皮细胞损伤血小板活性增强，细胞粘附分子表达增加，导致脑微小动脉血栓形成，白细胞粘附浸润增强，粘附的白细胞释放出自由基及细胞活性因子等引起自身免疫失常进而造成脑组织损伤，可能是一氧化碳中毒迟发脑病的重要发病因素之。高压氧治疗降低血小板活性，减轻内皮细胞损伤，使细胞粘附分子表达减少，从而减少了脑微小动脉血栓形成的因素，减轻了脑损伤。但仍未能使其很快恢复正常。
关键词：一氧化碳中毒迟发脑病 高压氧 血小板活性 粘附分子
急性一氧化碳中毒是我国北方地区的常见病、多发病。严重影响人民健康，甚至危及生
命。尤其是部分重度中毒患者经过一段假愈期后出现的一氧化碳中毒迟发脑病，使患者生活
不能自理，丧失工作能力。急性一氧化碳中毒病理生理过程中的许多机制迄今仍不十分明
了，目前认为，脑小动脉内皮细胞缺氧变性、微小血栓形成、自由基损伤、变态反应及自身免疫因素在急性一氧化碳中毒迟发性脑病的发生发展中起重要作用。而血小板、血管内皮细胞及粘附分子间的相互间作用对炎性损伤、血栓形成、再灌注损伤及自身免疫等的影响亦越来越引起人们的极大兴趣。本课题为探讨一氧化碳中毒迟发脑病的发病机理及探索更为确切有效的方案防治一氧化碳中毒迟发脑病提供了新的理论依据。对降低一氧化碳中毒迟发脑病的发生率、致残率及死亡率有现实意义。
材料与方法
1．实验动物
健康成年Wistar大鼠共128只，雌雄不拘，体重200~250g，购自首都医科大学实验动物室。动物号为：医动字D01－3084。
2．分组：实验动物被随机分成16组。正常对照组8只、CO中毒（CO）后第l、5、10、15、20天组各8只，CO中毒+高气压（CP）处置后第1、5、10、15、20天组各8只。CO中毒+高压氧（CH）处置后第1、5、10、15、20天组各8只。
（1）正常对照组
在静式染毒柜中呼吸率空气1h后抽血进行血浆循环内皮细胞计数。外周血血小板体积、血小板CD61、及外周血多形核白细胞粘附分子CD11b／CD18的测定。
（2）CO中毒组 在制成ACOP模型后第l、5、10、15、20天取血检测。不进行高压氧及高气压处理。
（3）CO中毒+高气压组
在制成ACOP模型后每日进高压舱1次，但呼吸空气而非纯氧。在高气压处置后第1、5、10、15、20天取血检测。
（4）CO中毒+高压氧组
在制成ACOP模型后每日行高压氧处置1次，分别于高压氧处置后第l、5、10、15、20天取血检测。
3．主要仪器设备
（1）北京红十字朝阳医院高压氧科国产3舱7门大型高压空气舱群
（2）0.1m3静式染毒柜（由职业病研究所提供）
（3）美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪
4．ACOP大鼠模型的制作
（1）染毒气体
用纯度为99.9％的一氧化碳（由北京特种气体研究所提供）将柜内气体配成一氧化碳含量为2800ppm充分混匀的有毒气体。
（2）染毒方法
每次染毒的大鼠数为8只[按动物总体重（kg）×50－100 L公式计算]，每次染毒时间为1h，使中毒大鼠血浆碳氧血红蛋白含量平均达到70％（参照Jiang或染毒法）。
（3）染毒时症状表现
染毒开始时大鼠活动正常，约5~10min时躁动不安；约15~20min时瘫软卧伏懒动；约20~30min时大鼠出现窜蹦，呼吸急促，便溺；30min后均蜷缩不动，皮毛乍起；到60min停止染毒时个别大鼠死亡（死亡率约为7％）。
5．实验动物的高压氧处置
（1）高压氧处置方法
实验动物CO中毒后第l、5、10、15、20天各组大鼠均放入80×40cm的特制木箱中进行高压氧处理。箱子1侧接输氧管，另1侧有10个直径6cm的出气门，给氧10min后在出气门测定有浓度为99.8％。
（2）高压氧处置步骤
采用高压空气舱群，升压25min，升压至0.2MPa后稳压吸氧60min，减压40min，每日l次。
（3）高压氧处置时症状表现
给氧初始大鼠活动正常，给氧40min后大鼠开始活跃，给氧60min后大鼠均亢奋，减压时大鼠开始恢复平静，无抽搐和死亡。
6．标本的采集
（1）先将大鼠用乙醚进行麻醉。
（2）将大鼠固定在手术台上，直接取心脏血液3ml。
（3）迅速将所采全血等分，分别置于装有枸橼酸钠的抗凝管中各1ml，充分混匀。
（4）将上述抗凝血置于离心机中，离心5min，分别进行下述测定。
7．检测项目及原理
（1）外周血血小板CD61测定：用前述方法采集标本，上机检测前用BD公司标准Beads校准流式细胞仪，使CV值小于2％，用实验管的平均荧光强度与对照管的平均荧光强度的比值表示CD61的相对表达量。
（2）外周血循环内皮细胞测定：用CD31与CD45双标记外周血，对外周血有核细胞设门，每例收集5万个有核细胞，统计有核细胞中CD45阴性，CD31强阳性的细胞数，即血管内皮细胞数。
（3）外周血血小板相对体积的测定：方法同（1）。用FSC的平均值表示血小板的平均体积。
（4）外周血多形核白细胞粘附分子CD11b／CD18的测定：用实验管中性粒细胞的平均荧光强度与对照管中性粒细胞的平均荧光强度的比值表示CD11b／CD18的相对表达量。
8．统计学处理 采用SPSS 8.0版统计学软件包进行统计学分析
（1）根据实验结果所得各组数据建立数据文件，对各组数据分布的正态性进行检验，对各级数据间的方差齐性进行检验。
（2）分别对CO、CP、CH组CO中毒后第l、5、10、15、20天的外周血血小板相对体积、外周血血小板CD61、外周血循环内皮细胞及外周血多形核白细胞粘附分子CD11b／CD18值与对照组相应数值进行两组独立样本的t检验，以P＜0.05作为显著性差异的标准。
（3）对CO、CP、CH组及对照组第l、5、10、15、20天的外周血血小板相对体积、外周血血小板CD61、外周血循环内皮细胞及外周血多形核白细胞粘附分子CD11b／CD18值先以One-Way-ANOV进行各组的单因素方差分析。在单因素方差分析具有显著性差异的基础上，再以Student-Newman-Keuls检验进行各级之间的两两比较。以P＜0.05作为显著性差异的标准。
（4）对大鼠外周血血小板相对体积、外周血血小板CD61、外周血循环内皮细胞及外周血多形核白细胞粘附分子CD11b／CD18的统计数据相互之间用Pearson方法进行多元相关分析。并列出上述各组相关数据之间的散点图。
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