高压氧对大鼠缺血再灌注脑组织学和超微结构的实验研究
摘要：本题以WISTAR大鼠为研究对象，制成脑缺血再灌注动物模型，将大鼠分为治疗组和对照组各50只。治疗组每日行高压氧治疗一次，压力0.2MPa，时限稳压吸氧60MPa，疗程21次，分别于缺血再灌注后1、3、7、14、21天处死各10只鼠动态观察高压氧不同治疗时限对脑组织组织学和超微结构的影响。并经统计学处理。结果显示，高压氧可以降低缺血再灌注时神经元的损伤程度；加速受损神经细胞的修复；使严重变性的神经细胞免除死亡走向修复。
关键词：高压氧、缺血再灌注、脑神经元、超微结构
迄今为止，高压氧对缺血再灌注后神经元超微结构的影响国外尚无报告，国内仅有两篇报告，但结论不同。以上实验均是在脑缺血再灌注后行高压氧治疗一次，不能动态反应高压氧对脑缺血损伤组织的影响。本文采用临床上高压氧治疗缺血性脑血管病的压力(0.2MPa)、时限（稳压吸氧60min）、疗程（21次），系统研究高压氧对缺血再灌注大鼠神经元组织学和超微结构的影响，以探讨高压氧对缺血再灌注损伤脑组织的保护作用。
材料与方法
1．实验对象：
健康成年WISTAR大鼠。北京医科大学动物室提供，合格证号：医动字01－3056。体重200-250g，雌雄不限，共l00只。
2．模型制备：
采用PULSINELLI四动脉闭塞法。以戊巴比妥钠（45mg/kg）腹腔麻醉，自颈部切开暴露并游离双侧颈总动脉，置丝线待用。然后作项背正中切口，分离椎旁肌暴露第1颈椎翼状孔，用电烧针电凝其下的椎动脉。24小时后以待用丝线结扎双颈动脉，阻断血流70分钟后剪断丝线，制成脑缺血一再灌注动物模型。
3．实验分组：
将100只模型鼠随机分成治疗组和对照组，每组各50只。治疗组术后当日起每日进高压氧舱治疗1次，持续到检测时。对照组与治疗组在同等条件下饲养，但不作任何处理，直到检测时。
4．高压氧条件：
将动物置入特制木箱中，箱下方设供氧管入口，箱顶设出气口。采用直排式给氧，给氧2min后在出气口测排出气体氧浓度为98.8％。将木箱置于舱内，舱内温度24土2℃，升压30min，升压至0.2MPa时稳压，持续给氧60min，减压4min，每日1次。
5．检测分期与方法：
将两组模型鼠随机按术后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天各分五期，每期10只鼠。将受检鼠断头处死，每只取额颞叶皮质各两块，一块用10％甲醛固定，制成组织切片，HE染色供光镜观察。另一块用2.5％戊二醛固定，常规制成超薄切片供电镜观察。
6．电镜观察：
日本产H500型电镜。每只实验动物均观察20个神经元细胞体，同时对胶质细胞进行观察，每个细胞中以多数细胞器的损伤程度为准，按下述标准对核膜、染色质、线粒体、内质网、高尔基体等进行观察、记录（上述细胞器无明显变化时均记为“一”）。
（1）核膜：
“＋”双层膜完好，轻度肿胀，间隙加宽，核孔清楚，双层膜可能不平行，外膜发皱或呈波纹状。
“＋＋”肿胀严重，双层膜间隙加宽各处不同，外膜发皱或核膜折皱，但孩膜核孔尚清楚，有个别处可能不清楚。
“＋＋＋”肿胀更加严重，外膜有破坏或絮状不清，核孔不清楚，外膜破坏严重或核固缩。
（2）染色质：
“＋”常染色质、异染色质分布正常，无丢失，无空泡，核仁有或无。
“＋＋”常染色质尚均匀或不均匀，有空泡，核仁有或无。
“＋＋＋”常染色质稀疏不均，有部分丢失，空泡很多，无核仁。
（3）线粒体：
“＋”内外膜尚清楚，可见膜间隙，有肿胀，嵴膜清楚，嵴间隙扩大，嵴似漂浮在液中。
“＋＋”内外膜完全粘成一层，嵴模糊或减少，嵴间隙增大，水肿严重或空处，基质有絮状物。
“＋＋＋”内外膜一层或有破坏，嵴完全消失或残余絮状物，线粒体中有大空泡或中空，或有时有严重固缩。
（4）内质网：
“＋”膜完好，间隙加宽，肿胀，无脱粒现象。
“＋＋”膜完好，肿胀严重，膜间不平行或形成各种形状，少有脱粒或不脱粒。
“＋＋＋”膜有破坏或不破坏，内质网呈不定形，池中空，完全脱粒或脱粒严重，形成大泡。
（5）高尔基体：
“＋”膜清晰完好，有肿胀，扁囊还存在。
“＋＋”膜清楚完好，肿胀严重成一堆泡，扁囊消失。
“＋＋＋”膜有破坏，肿胀极度严重，大空泡不定形。
1．Wistar鼠大体改变烧灼椎动脉后两组鼠的主要表现是运动失衡，行走转圈，甚至不敢睁眼，不进食水。颈动脉阻断后，两组鼠均出现翻正反射消失，四肢无力。高压氧治疗一次后，两组鼠改变不明显。第三次高压氧治疗后，治疗组行走正常，四肢有力，进食水正常。对照组鼠仍不能走直线，四肢欠有力，但进食水正常。第五次高压氧治疗后，对照组鼠恢复正常。
2．组织学改变
脑缺血再灌注后第一天，大脑皮层出现小片状疏松区，神经元及胶质细胞水肿，部分细胞核染色质分布不均，核内出现空白区，但核膜保持完整，少数细胞质出现空泡，此时，治疗组与对照组组织学改变无显著差异。第三天，对照组大脑皮质分子层出现大片状疏松区，神经元及肢质细胞水肿更加明显，大部分细胞核染色质分布不均，核内出现空白区，有些细胞核膜破裂，部分细胞胞质出现空泡，部分细胞胞质浓缩，嗜酸性增强，并可见点片状及单个细胞的坏死；治疗组脑组织的损伤明显轻于对照组，不见点片状细胞坏死，仅偶见单个细胞的坏死。第七天，治疗组脑细胞损伤明显改善，大脑皮质分子层疏松区缩小，神经元及胶质细胞水肿明显减轻；此时，对照组脑细胞损伤虽有所改善但远不如治疗组明显。第十四天，治疗组脑组织的损伤已基本得到修复，光镜下已看不出明显的病变；此时对照组大脑皮质分子层有片状疏松区，可见片状液化性坏死灶，部分细胞核染色质仍分布不均，核内仍有空白区，细胞质仍有空泡，并见局灶性胶质细胞的增生及嗜神经元现象。第二十一天，虽然对照组细胞的病理改变基本恢复，但大脑皮质分子层稀疏区和液化坏死灶较前无进一步缩小。
3．超微结构的改变
（l）核膜的改变如表l所示。经χ2检验，脑缺血再灌注后第一天，治疗组与对照组核膜的损伤程度无显著性差异（P＞0.05）；脑缺血再灌注第三天（P＜0.001)、七天（P＜0.05)、十四天（P＜0.05)、二十一天（P＜O.05），治疗组与对照组核膜的损伤程度均有显著性差异。
（2）染色质的改变如表2所示，经χ2检验，脑缺血再想往后第一天，治疗组与对照组染色质的改变无显著性差异（P＞0.05）；脑缺血再灌注第三天（P＜0．001)、七天（P＜O．001)，十四天（P＜O.05)及第二十一天（P＜0.05），治疗组与对照组染色质的改变均有显著性差异。
（3）线粒体的改变如表3所示。经检验，脑缺血再灌注后第一天，治疗组与对照组线粒体的损伤程度无显著性差异（P＞O.05）；脑缺血再灌注第三天（P＜0.001)、七天（P＜O．001)、十四天（P＜0.001)及第二十一天（P＜0.05），治疗组与对照组线粒体的损伤均有显著性差异。
（4）内质网的改变如表4所示。经χ2检验，脑缺血再灌注后第一天，治疗组与对照组内质网的损伤程度无显著性差异（P＞O.05）；脑缺血再灌注后第三天（P＜O.001)、七天（P＜O.001)、十四天（P＜0.05)及第二十一天（P＜0.05），治疗组与对照组内质网的损伤程度均有显著性差异。
（5）高尔基体的改变如表5所示。经χ2检验，缺血再灌注后第一天，治疗组与对照组线粒体的损伤程度无显著性差异（P＞0.05）；缺血再灌注后第三天（P＜0.001)、七天（P＜0.001)、十四天（P＜O.001)及第二十一天（P＜0.05），治疗组与对照组高尔基体的损伤程度均有显著性差异。
除上述细胞器的变化外，对照组于脑缺血再灌注后第三天、第七天及第十四天均可见单个细胞的死亡，而治疗组则始终未见细胞的死亡。
统计学处理采用SYSTAT统计学软件
表1 核膜的改变
| |
一天
|
三天
|
七天
|
十四天
|
二十一天
|
| |
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
|
-
|
24
|
21
|
0
|
0
|
9
|
2
|
61
|
6
|
56
|
50
|
|
+
|
73
|
55
|
33
|
7
|
60
|
18
|
19
|
51
|
2
|
10
|
|
++
|
3
|
4
|
40
|
77
|
10
|
53
|
0
|
3
|
0
|
0
|
|
+++
|
0
|
0
|
7
|
46
|
1
|
7
|
0
|
0
|
0
|
0
|
表2 染色质的改变
| |
一天
|
三天
|
七天
|
十四天
|
二十一天
|
| |
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
|
-
|
45
|
39
|
4
|
0
|
21
|
14
|
76
|
49
|
60
|
52
|
|
+
|
55
|
41
|
65
|
29
|
59
|
53
|
2
|
11
|
0
|
8
|
|
++
|
0
|
0
|
11
|
39
|
0
|
13
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
+++
|
0
|
0
|
0
|
12
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
表3 线粒体的改变
| |
一天
|
三天
|
七天
|
十四天
|
二十一天
|
| |
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
|
-
|
9
|
10
|
0
|
0
|
7
|
3
|
61
|
22
|
59
|
50
|
|
+
|
52
|
41
|
11
|
9
|
46
|
6
|
19
|
28
|
1
|
7
|
|
++
|
39
|
29
|
61
|
30
|
27
|
48
|
0
|
10
|
0
|
3
|
|
+++
|
0
|
0
|
8
|
41
|
0
|
23
|
0
|
0
|
0
|
0
|
表4 内质网的改变
| |
一天
|
三天
|
七天
|
十四天
|
二十一天
|
| |
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
|
-
|
10
|
6
|
0
|
0
|
8
|
2
|
54
|
28
|
59
|
52
|
|
+
|
55
|
49
|
23
|
1
|
36
|
8
|
26
|
32
|
1
|
8
|
|
++
|
31
|
19
|
41
|
29
|
35
|
58
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
+++
|
4
|
4
|
16
|
50
|
1
|
12
|
0
|
0
|
0
|
0
|
表5 高尔基体的改变
| |
一天
|
三天
|
七天
|
十四天
|
二十一天
|
| |
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
治疗
|
对照
|
|
-
|
26
|
21
|
2
|
0
|
10
|
2
|
61
|
21
|
44
|
38
|
|
+
|
47
|
43
|
41
|
11
|
38
|
26
|
5
|
32
|
1
|
6
|
|
++
|
11
|
2
|
20
|
21
|
9
|
31
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|
+++
|
0
|
0
|
0
|
15
|
0
|
4
|
0
|
0
|
0
|
0
|
讨论
一、高压氧减轻脑神经细胞损伤的程度。
缺血再灌注后第一天，治疗组与对照组组织学及超微结构的改变无明显差别，第三天，光镜下治疗组大脑皮质分子层虽也出现大片疏松区，神经元细胞明显水肿，但其损伤的范围及损伤的程度均轻于对照组，未见点片状坏死，仅偶见单个细胞的坏死。电镜下可见细胞核膜、染色质及线粒体、内质网、高尔基体等细胞器受损程度明显轻于对照组，χ2检验两组具有非常显著性差异。由此可见，高压氧对神经细胞具有保护作用，能减轻因脑缺血对神经细胞损伤的程度。
二、高压氧加速受损细胞的修复。
缺血再灌注后第七天，治疗组脑组织的损伤程度得到明显改善，光镜下可见，大脑皮质分子层疏松区明显减少，神经元细胞水肿明显减轻。对照组脑细胞损伤虽有所改善，但远不如治疗组明显。电镜下，治疗组神经元超微结构受损的数量比对照组少，受损的程度比对照组轻，两组具有非常显著性差异。
三、高压氧使严重变性的神经细胞免除死亡走向恢复。
第十四天，治疗组脑组织的损伤已基本上得到修复，光镜下已看不出明显的病理改变。而此时的对照组大脑皮质分子层仍可见片状疏松区和片状液化坏死灶，神经元细胞仍有明显水肿。电镜下，治疗组神经元只有少数细胞器有轻度水肿，其受损细胞器的数量显著少于对照组，受损的程度也明显轻于对照组，两组具有非常显著性差异。第二十一天，光镜下，对照组大脑皮质分子层稀疏区和液化坏死灶仍存在。电镜下，治疗组仅有个别细胞器有轻度水肿，而对照组仍有部分细胞器有轻到中度水肿，χ2检验显示两组受损细胞器的数量及程度均有显著性差异。上述实验结果说明，高压氧不仅能减轻神经元及胶质细胞因缺血而受损伤的程度，同时还能加速受损细胞的修复；及时的高压氧治疗可使一些受损细胞早治疗，早恢复，并可使一些蜕变中的神经元走向恢复，而对照组的受损细胞很可能得不到恢复而死亡。胶质细胞的改变和神经元细胞的改变基本平行只是损伤的程度稍轻，说明高压氧的作用是广泛的。急性脑缺氧时，线粒体内的氧化磷酸化不能正常进行，细胞内无氧酵解增强，乳酸堆积，AIP产生减少，钠泵运转停止，造成细胞内水肿和细胞间质水肿。缺血再灌注后，氧不全代谢产物明显增加，提供了大量氢离子和电子供体，导致自由基迅速增加，其结果是脑组织广泛损伤，缺氧使钙泵运转停止，钙通道开放引起细胞内钙超载。由于细胞内Ca2﹢过多，激活磷脂酶A2，启动花生四烯酸（AA）转化为前列腺素的瀑布反应，其结果是血栓素（TXA2）增多，其有收缩血管，促进血小板聚集的作用。高压氧增加血氧含量，增加血氧弥散力，提高脑组织氧张力，改变细胞组织的供氧状态，打断了脑缺氧一脑水肿的恶性循环。由于血氧弥散力增加，特别改善了处于缺血半影区可逆细胞的供氧状态。脑缺氧纠正后，线粒体内氧化磷酸化反应正常进行，钠泵功能恢复，脑水肿减轻。近期有实验证实，高压氧可以使钙泵功能恢复，减轻钙超载。减少AXT2产生。以上从物理和生化的角度论征了高压氧治疗减轻脑损伤的作用。本研究用电子显微镜观察方法，观察足够数量的神经细胞，并通过统计学处理证实高压氧对缺血再灌注损伤的脑组织超微结构的影响和治疗作用，为临床上高压氧治疗缺血性脑血管病提供了细胞形态学的依据。
